PCR ย่อมาจาก Polymerase Chain Reaction หรือ ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส คือ เทคนิคในห้อง ปฏิบัติการทางชีววิทยาระดับโมเลกุล เป็นกระบวนการสังเคราะห์และเพิ่มจำนวนชิ้นส่วนดีเอ็นเอ (DNA) ที่ต้องการให้มีปริมาณมากขึ้นในเวลาอันรวดเร็ว ภายใต้การทำงานของเอนไซม์ในสภาพที่มีการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิซ้ำๆ ซึ่งได้รับความนิยมและมีการประยุกต์ใช้อย่างกว้างขวางในการศึกษาสารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต
PCR ถูกเลียนแบบมาจากกระบวนการสังเคราะห์ดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิต โดยต้องอาศัยองค์ประกอบสำคัญหลายชนิด ได้แก่
1. DNA ต้นแบบ (DNA template) เป็นส่วนของสายดีเอ็นเอหรือยีนที่ต้องการศึกษา
- สกัด DNA ได้จากเซลล์หรือเนื้อเยื่อของสิ่งมีชีวิต
- RNA ไม่สามารถนำไปเพิ่มจำนวนด้วย PCR ได้โดยตรง เนื่องจากมีความเปราะบาง ดังนั้นจึงต้องเปลี่ยน RNA ให้เป็น complementary DNA (cDNA) โดยใช้เอนไซม์ reverse transcriptase จึงเรียกเทคนิคนี้ว่า RT-PCR
2. ไพรเมอร์ (Primer) เป็นดีเอ็นเอสายสั้น ๆ (DNA oligonucleotides) ประมาณ 15-30 เบส ที่มีลำดับเบสคู่สม (complementary) กับ DNA template ซึ่งทำหน้าที่กำหนดขอบเขตของบริเวณที่จะเพิ่มจำนวน ในการทำ PCR ไพรเมอร์จะมีจำนวนอย่างน้อย 1 คู่ ได้แก่ forward primer และ reverse primer
การออกแบบไพรเมอร์ต้องมีความจำเพาะเจาะจงต่อดีเอ็นเอต้นแบบ เพื่อไม่ให้เกิด primer dimer (ไพรเมอร์ทั้งสองสายจับกันเอง) และหลีกเลี่ยงลำดับเบสที่ทำให้ไพรเมอร์จับตัวเอง (Self-complementary) หรือการเกิด hairpin loop
3. เอนไซม์ DNA polymerase เป็นเอนไซม์ที่ใช้ในการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่ ซึ่งสกัดได้จากแบคทีเรียที่อาศัยตามบ่อน้ำพุร้อน คือ Thermus aquaticus เอนไซม์ที่ได้จะเรียกว่า Taq DNA polymerase ทนต่อความร้อนได้สูงโดยไม่มีการเสียสภาพ
4. Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) คือ นิวคลีโอไทด์ที่ประกอบด้วย 4 ชนิด คือ dATP, dTTP, dGTP, dCTP ทำหน้าที่เป็นวัตถุดิบในการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่
5. Magnesium ion (Mg2+) ทำหน้าที่เป็น cofactor ของเอนไซม์ DNA polymerase ที่ช่วยให้สามารถรวม dNTPs ได้ในระหว่างการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่
6. บัฟเฟอร์ (Buffer) เป็นสารละลายที่ช่วยจัดสภาพแวดล้อมทางเคมีให้เหมาะสมกับการทำงานของ DNA polymerase เพื่อช่วยให้เอนไซม์เสถียรและทำงานได้ดี
กระบวนการ PCR ประกอบด้วยขั้นตอนหลัก 3 ขั้นตอน ได้แก่ denaturation, annealing และ extension ซึ่งเกิดขึ้นเป็นรอบ ๆ หรือ cycle ดังนี้
1. Denaturation เป็นขั้นตอนเพิ่มอุณหภูมิ เพื่อทำให้ DNA สายคู่ (double strand DNA) แยกออกจากกันเป็น DNA สายเดี่ยว (single strand DNA) โดยใช้อุณหภูมิสูงประมาณ 90-95˚C ในการทำลายพันธะไฮโดรเจน
2. Annealing เป็นขั้นตอนลดอุณหภูมิ เพื่อให้ไพรเมอร์สามารถจับกับลำดับเบสบนดีเอ็นเอต้นแบบได้อย่างจำเพาะ โดยลดอุณหภูมิลงให้อยู่ในช่วง 50-65˚C
3. Extension เป็นขั้นตอนที่มีการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ต่อจากไพรเมอร์ที่จับกับดีเอ็นเอต้นแบบ ซึ่ง DNA polymerase จะเติม dNTPs ต่อจากบริเวณ primer ที่อุณหภูมิประมาณ 70-72°C ซึ่งเป็นอุณหภูมิที่พอเหมาะกับการทำงานของ Taq DNA polymerase
เมื่อทำครบทั้ง 3 ขั้นตอน เท่ากับ 1 รอบปฏิกิริยา PCR ดีเอ็นเอเป้าหมายจะถูกเพิ่มจำนวนขึ้น และเมื่อทำซ้ำหลายรอบจะเพิ่มขึ้นในลักษณะเกือบทวีคูณในช่วงแรกของปฏิกิริยา ดังนั้น แม้ DNA เป้าหมายจะมีปริมาณเริ่มต้นเพียงเล็กน้อย ก็สามารถเพิ่มปริมาณให้เพียงพอต่อการตรวจวิเคราะห์ได้ นอกจากนี้ ต้องมีการทำ gel electrophoresis เพื่อตรวจสอบดูทั้งปริมาณและขนาดของ product เมื่อสิ้นสุดปฏิกิริยา
qPCR และความแตกต่างจาก PCR แบบดั้งเดิม (conventional PCR)
quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) หรือที่เรียกอีกชื่อหนึ่งว่า Real-time PCR เป็นเทคนิคที่พัฒนาต่อยอดจาก PCR โดยมีจุดเด่นคือสามารถติดตามการเพิ่มขึ้นของ PCR product ได้ในระหว่างที่ปฏิกิริยากำลังดำเนินอยู่ จึงสามารถใช้ในการหาปริมาณสารพันธุกรรมเริ่มต้นได้ด้วย ในขณะที่ PCR แบบดั้งเดิมต้องรอให้ปฏิกิริยาสิ้นสุดแล้วจึงตรวจสอบได้
qPCR อาศัยสัญญาณ fluorescence ที่เพิ่มขึ้นตามปริมาณ PCR product เช่น การใช้สารเรืองแสง DNA-binding dye เช่น SYBR Green หรือการใช้โพรบที่มีความจำเพาะ เช่น TaqMan probe เมื่อดีเอ็นเอเพิ่มขึ้น สัญญาณ fluorescence ก็จะเพิ่มขึ้นตามไปด้วย เครื่อง qPCR จะตรวจวัดสัญญาณดังกล่าวในแต่ละรอบของปฏิกิริยาและสร้างกราฟการเพิ่มขึ้นของสัญญาณ โดยวิเคราะห์ค่า Cq หรือ Ct (cycle quantification/cycle threshold) ที่ใช้ระบุรอบสัญญาณ fluorescence โดยทั่วไปดีเอ็นเอเป้าหมายมีปริมาณมากจะเข้าสู่ช่วงตรวจพบได้เร็วกว่า จึงมีค่า Ct/Cq ต่ำกว่า ในทางกลับกัน ดีเอ็นเอเป้าหมายที่มีปริมาณน้อยจะมีค่า Ct/Cq สูงกว่า
การวิเคราะห์และวัดปริมาณสารพันธุกรรมด้วยเทคนิค qPCR สามารถใช้ได้ทั้งการหาปริมาณแบบสัมบูรณ์ และการหาปริมาณแบบสัมพัทธ์
• การหาปริมาณแบบสัมบูรณ์ (absolute quantification) เป็นการสร้าง standard curve เพื่อเปรียบเทียบกับตัวอย่างมาตรฐานที่ทราบปริมาณ เช่น การตรวจหา viral load, การหาจำนวน Copy number ของยีน
• การหาปริมาณแบบสัมพัทธ์ (relative quantification) เป็นการเปรียบเทียบระดับการแสดงออกของยีนเป้าหมายกับยีนอ้างอิง (reference/housekeeping gene)
การประยุกต์ใช้ PCR และ qPCR ในงานต่าง ๆ
1. การวินิจฉัยและตรวจหาเชื้อก่อโรค: การตรวจหาเชื้อก่อโรค เช่น ไวรัส แบคทีเรีย และจุลินทรีย์บางชนิด มีความสำคัญในการตรวจวินิจฉัยโรคติดเชื้อและการเฝ้าระวังการแพร่ระบาด
2. การศึกษาการแสดงออกของยีน: RT-qPCR เป็นหนึ่งในเทคนิคพื้นฐานที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาการแสดงออกของยีน สามารถเปรียบเทียบระดับ mRNA ของยีนเป้าหมายระหว่างกลุ่มตัวอย่างได้
3. งานวิจัยด้านมะเร็งและชีวการแพทย์: การศึกษายีนที่เกี่ยวข้องกับการเกิดและการพัฒนาของมะเร็ง เช่น ยีนที่เกี่ยวข้องกับการแบ่งตัวของเซลล์ การตายของเซลล์ และการตอบสนองต่อยา
4. งานด้านพันธุศาสตร์: งานพันธุวิศวกรรมและการโคลนยีน การตรวจสอบความหลากหลายทางชีวภาพ การวิเคราะห์รหัสพันธุกรรม (sequencing) หรือการตรวจสอบความยาวของชิ้น DNA
5. งานด้านนิติวิทยาศาสตร์ (Forensic Science): ใช้ในการพิสูจน์เอกลักษณ์บุคคลเพื่อเทียบรอยนิ้วมือดีเอ็นเอ (DNA Fingerprinting) การเปรียบเทียบรหัสพันธุกรรม STR (Short Tandem Repeat) เพื่อยืนยันความเป็นพ่อ-แม่-ลูก หรือญาติร่วมสายโลหิตในคดีความต่างๆ
6. การเกษตรและการปรับปรุงพันธุ์พืช: ตรวจสอบยีนที่เกี่ยวข้องกับลักษณะสำคัญของพืช เช่น ความต้านทานโรค ความทนแล้ง หรือคุณสมบัติทางการเกษตรอื่น ๆ เพื่อช่วยคัดเลือกพืชที่มีลักษณะทางพันธุกรรมตามต้องการ
7. อุตสาหกรรมอาหารและการตรวจสอบสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม: ตรวจสอบชนิดของวัตถุดิบหรือสิ่งมีชีวิตที่อยู่ในอาหาร รวมถึงการตรวจสอบองค์ประกอบที่เกี่ยวข้องกับสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม (GMO)
PCR และ qPCR เป็นเทคนิคพื้นฐานที่มีความสำคัญอย่างมากในการเพิ่มจำนวน DNA เป้าหมาย และถูกนำไปใช้อย่างแพร่หลาย หากกำลังมองหาอุปกรณ์เครื่อง PCR, qPCR และน้ำยาสำหรับปฏิบัติการต่างๆ สามารถรับชมสินค้าผ่านเว็บไซต์ของบริษัทสมาร์ทไซเอนซ์
