TSAPLus Fluorescent Triple Staining Kit

Product Information

Description

This TSAPLus Fluorescence 3-Label 4-Color Staining Kit is used for multiple immunofluorescence staining of paraffin sections, especially for multiple immunofluorescence labeling of primary antibodies from the same source, and can also be used for multiple fluorescence immunolabeling of antibodies of different sources. The main principle of this kit is based on the tyramide signal amplification, short for TSA technology. The main principle of TSA technology is to utilize the peroxidase reaction of tyramide (i.e., fluorescently labeled tyramide salts form covalent bond binding sites under HRP-catalyzed H2O2) to generate a large number of enzymatic reactions, which can bind to surrounding protein residues (including tryptophan, histidine, and tyrosine residues) to form a large number of fluorescein deposition in the antigen-antibody binding site to achieve signal amplification. This kit uses fluorescent dye 488/555/647 to label tyramine, and the obtained fluorescent tyramine has strong fluorescence and stable signal, which can be used for multiple repeated immunolabeling to achieve multiple fluorescence staining.

In addition to the combination of fluorescent dyes in this kit, other suitable fluorescent dyes can also be selected according to the user's fluorescence imaging system light source configuration to match the combination of kits to carry out TSA fluorescence multilabeling experiments.

Fluorescence spectrum data of fluorescent dyes associated with TSA series fluorescence staining kits are as follows:

Storage and Handling Conditions

Each component in the kit is stored according to the required conditions, ship with wet ice. Valid for 12 months.

Component

Experiment Preparation

1. Prepare 0.01 mol/L PBS buffer (pH7.0-7.4, recommended G4202 or G0002), 3% H2O2 and 0.3% H2O2.

2. Prepare primary antibody and corresponding HRP labeled secondary antibody, antigen repair solution (select appropriate antigen repair solution according to antibody and tissue type).

3. According to the dosage, prepare TSA working solution according to the following proportion.

Note: Fluorescent Tyramide is melted and centrifuged in a centrifuge for a short period of time, clean pipette tips are blown and mixed and taken up. The TSA working solution is recommended to be prepared on the spot, and should be stored at 4 protected from light, and this solution is effective within 24 h. 

Usage

Taking tissue sections as an example, the experimental water used in the following experimental steps is pure water:

1. Tissue sections were dewaxed to water.

2. Antigen repair: According to the sample type and primary antibody used, antigen repair was performed on the tissue sections in an appropriate manner. Then rinse the tissue with PBS three times for 5 min each.

3. The tissues were marked by drawing circles with a Liquid Blocker PAP Pen. 

4. Inactivation of endogenous peroxidase: 3% H2O2 was added to the sections to cover the tissue and incubated at room temperature in the dark for 25 min to block endogenous peroxidase and reduce non-specific background staining. Wash with PBS 3 times, 5 min each time.

5. Sealing: After the sections were slightly dried, 3% BSA or serum was added to the tissue to block for 30 min. The sealing reagent was determined according to the species of primary antibody and secondary antibody.

6. Primary antibody incubation: Dilute the primary antibody to the appropriate concentration with PBS (or other antibody diluent). Gently remove the liquid from the section, add the diluted primary antibody to cover the tissue, and place the section flat in a wet box with water and incubate overnight at 4°C. Wash with PBS 3 times, 5 min each time.

7. Incubation of HRP secondary antibody: Dilute the secondary antibody to appropriate concentration with PBS (or other antibody diluent), add the secondary antibody to the tissue, and incubate at room temperature for 50 min. Wash with PBS 3 times, 5 min each time.

8. Add 50-100 μL TSA-488 staining working solution to the tissue to ensure complete coverage of the tissue, and incubate at room temperature for 10 min in the dark. Wash with PBS 3 times, 5 min each time.

9. Microwave treatment: Tissue sections were placed in a repair box filled with antigen repair solution (appropriate antigen repair solution selected according to the tissue type and antibody) for microwave heating treatment to remove the bound primary and secondary antibodies. (Heating temperature and time: heating to 95 or above, maintain 15 minutes.) During this step, prevent excessive evaporation of liquid resulting in dry flakes. 

10. Repeat step 6 for incubation of the second primary antibody: Dilute the second antibody (primary antibody) to the appropriate concentration with PBS (or another antibody diluent). Gently shake off the liquid on the section, drop the diluted antibody to cover the tissue, and put the section flat in a wet box with water and incubate overnight at 4 . Wash with PBS 3 times, 5 min each time.

11. Repeat Step 7 to incubate the corresponding HRP secondary antibody: dilute the secondary antibody to appropriate concentration with PBS (or other antibody diluent), add the secondary antibody to the tissue, and incubate at room temperature for 50 min. Wash with PBS 3 times, 5 min each time.

12. Add 50-100 μL TSA-555 staining working solution to the tissue to ensure complete coverage of the tissue, and incubate at room temperature for 10 min in the dark. Wash with PBS 3 times, 5 min each time.

13. Microwave treatment: Tissue sections were placed in a repair box filled with antigen repair solution (appropriate antigen repair solution selected according to the tissue type and antibody) for microwave heating treatment to remove the bound primary and secondary antibodies. (Heating temperature and time: heating to 95 or above, maintain 15 minutes.) During this step, prevent excessive evaporation of liquid resulting in dry flakes.

14. Repeat step 6 for incubation of the third primary antibody: Dilute the third antibody (primary antibody) to the appropriate concentration with PBS (or another antibody diluent). Gently shake off the liquid on the section, drop the diluted antibody to cover the tissue, and put the section flat in a wet box with water and incubate overnight at 4 . Wash with PBS 3 times, 5 min each time.

15. Repeat Step 7 to incubate the corresponding HRP secondary antibody: dilute the secondary antibody to appropriate concentration with PBS (or other antibody diluent), add the secondary antibody to the tissue, and incubate at room temperature for 50 min. Wash with PBS 3 times, 5 min each time.

16. Add 50-100 μL TSA-647 staining working solution to the tissue to ensure complete coverage of the tissue, and incubate at room temperature for 10 min in the dark. Wash with PBS 3 times, 5 min each time.

17. Nuclear counterstaining DAPI: After the sections were slightly dried, DAPI (ready-to-use) staining solution was added to the tissues by drop and incubated for 10 min at room temperature in the dark. Wash with PBS 3 times, 5 min each time.

18. Tissue autofluorescence quenching (optional): Add Tissue Autofluorescence Quencher (Sudan Black B) to the tissue, incubate at room temperature for 5 min, rinse with running water for 3 min.

19. Sealing and microscopic examination: After the sections are slightly dried, drop the Anti-Fade Mounting Medium to seal the slices. Fluorescence microscope or laser confocal microscope were used to observe and collect images. The slices can be stored at 4°C for 15 days in a light protected box.

Note

1. Compared with fluorescent secondary antibody, TSA kit has higher sensitivity and stronger signal. Therefore, the concentration of primary antibody should be reduced, and the dilution recommended by the antibody manual should be increased 5-10 times to reduce the background fluorescence caused by non-specific binding. It is recommended to set the gradient concentration of primary antibody to obtain the best effect.

2. If the background fluorescence is strong, add tissue autofluorescence quenching step. 

3. The recommended dilution ratio of fluorescent tyramide is 1:500, and the dilution ratio can be adjusted according to the experimental results (adjustment range: 1:200-1:1000).

4. For multiple fluorescent labeling, it is recommended to incubate the polyclonal antibody first and then the monoclonal antibody; the antibody corresponding to the high abundance target protein was incubated first, and then the antibody corresponding to the low abundance target protein was incubated.

For Research Use Only!

https://www.servicebio.com/goodsdetail?id=5692